激光共聚焦顯微鏡的樣品制備是一個復雜而精細的過程,旨在確保樣品在顯微鏡下能夠呈現(xiàn)高質(zhì)量的成像效果。以下是激光共聚焦顯微鏡樣品制備的一般步驟:
一、樣品準備
選擇合適的樣品:根據(jù)實驗目的和研究需求,選擇合適的細胞或組織樣品。樣品應具備良好的生物活性和顯微結(jié)構,如活體細胞、培養(yǎng)細胞、組織切片等。
樣品處理:
細胞樣品:對于細胞樣品,可以使用細胞爬片、培養(yǎng)皿等方法進行制備。細胞爬片時,需選擇質(zhì)量好、光潔、無雜質(zhì)的載玻片和蓋玻片,并進行相應的處理以確保其光學特性。
組織樣品:組織樣品通常需要進行切片處理,切片越薄越好,以便于單層組織標本能很好地貼附在樣品池中。
二、樣品固定
為了保持樣品的形態(tài)和結(jié)構,需要進行樣品的固定處理。常用的固定方法包括化學固定和物理固定。
化學固定:使用甲醛、乙醇、冰醋酸、戊醛等化學試劑進行固定。例如,組織樣本可以浸泡在緩沖福爾馬林中,然后進行脫水和浸漬。實驗室中常用的還有液氮冷凍法和多聚甲醛(PFA)固定法。液氮冷凍法是將新鮮組織直接放入液氮中保存;而多聚甲醛固定法則是將組織塊置于4% PFA中進行后固定,固定的時間可根據(jù)組織塊的大小和致密程度而調(diào)整。
物理固定:對于一些特殊的樣品,也可以采用物理方法進行固定,如冷凍固定等。
三、滲透處理
有些樣品在固定后會出現(xiàn)浸泡不透的情況,此時需要進行滲透處理,使固定液更好地滲透進入樣品中。常用的滲透處理方法包括冷凍冰醋酸滲透、冷凍減壓滲透、甘油滲透等。
四、包埋
將處理好的樣品包埋到透明的固定劑中,以保持其形態(tài)和結(jié)構。常用的包埋介質(zhì)包括瓊脂、明膠、聚乙二醇、樹脂等。包埋時要注意使樣品均勻分布在包埋劑中,以免出現(xiàn)偏移或扭曲。
五、切片
將包埋好的樣品切割成適當?shù)暮穸龋ǔ閹资⒚字翈装傥⒚住G衅姆椒ㄓ斜肚衅⒗鋬銮衅⑹炃衅取G衅瑫r需保持樣品的完整性和結(jié)構。
六、平片處理
將切好的樣品平片放在載玻片上,用適當?shù)姆椒▽⑵涔潭ㄔ诓F稀3S玫墓潭ǚ椒ㄓ袩崛邸⒗鋬觥㈦姾晌降取9潭ê笠_保樣品牢固地固定在玻片上并保持平坦。
七、染色與標記
根據(jù)需要,可以對樣品進行染色以增強顯微鏡觀察的效果。常用的染色方法有熒光染色、熒光蛋白標記、核酸染色等。此外,樣品還需經(jīng)熒光探劑標記,以便于在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。標記方法可包括單標、雙標、三標等。
八、清洗與封片
處理完樣品后,要對樣品進行適當?shù)那逑矗コ嗔舻墓潭▌⑷旧珓┑取H缓螅瑢⑻幚砗玫臉悠芳尤敕馄橘|(zhì),如卡賓膠、密封劑等,以減少光透射損失和防止樣品變干。
九、顯微鏡觀察
將制備好的樣品放入激光共聚焦顯微鏡中,調(diào)整焦距和曝光時間,進行觀察和拍攝。
綜上所述,激光共聚焦顯微鏡的樣品制備是一個涉及多個步驟的復雜過程,每一步都需要仔細操作和注意細節(jié),以保證樣品制備的質(zhì)量和可觀察性。